CRISPR辅助数字化验快速检测SARS-CoV-2

从细菌中分离出的CRISPR酶的发现不仅改变了我们编辑基因组的能力，从而治疗了许多遗传疾病，而且还为增强诊断测试打开了大门。

核酸测试可检测遗传信息，例如DNA和RNA，通常用于鉴定病毒或细菌。目前，它们被广泛用于SARS-CoV-2病毒的检测-对COVID-19大流行的需求前所未有，而LMAP(环介导的等温扩增)测试是其中之一。最常见的。

相比之下，基于CRISPR的核酸测定法更快，更可靠，特异且更便宜，并且已经发现可用于登革热病毒(DENV)，人乳头瘤病毒(HPV)和寨卡病毒(ZIKV)的检测。

约翰·霍普金斯大学(Johns Hopkins University)的杰夫·王(Jeff Wang)教授带领的一组科学家表示，他们的数字化不足却阻碍了他们。Wang说：“迄今为止，所有基于CRISPR的分析都是在反应管或反应孔中进行的。” “这种反应形式有两个缺点：样品中的病毒载量很难量化，因为它仅与信号强度相关，[和]病毒载量低的样品需要更长的时间才能产生可​​检测的信号。”

数字检测还是一种功能强大且可靠的工具，可增强诸如PCR和LAMP等测试的诊断能力，但基于CRISPR的同类产品尚未实现数字增强。

创建敏感的数字CRISPR分析

为了解决这个问题，该团队开发了一种称为deCOViD(数字化增强的CRISPR / Cas辅助单罐病毒检测)的检测方法，这是第一个可以检测SARS-CoV-2 RNA和一步即可加热灭活SARS-CoV-2。他们的研究结果最近发表在《先进科学》上。

Wang说：“我们基于CRISPR的数字化分析可以对样品中的单个病毒进行计数。” “它还为高病毒载量和低病毒载量的样品保持了持续快速的测定时间。”

该测定法使用荧光信号来检测病毒的存在与否-将病毒RNA的转录和扩增整合到一个步骤中，然后这些RNA片段激活RNA引导的CRISPR复合物以触发阳性样品中的荧光。

Wang解释说：“检测样本中的SARS-CoV-2病毒就像在大海捞针中发现针头一样普遍存在的问题。” 想象一下，即使针头可以自己复制，也仍然需要很长时间才能制作足够多的针头，并且在干草堆中变得可见。但是，如果首先将干草堆分成许多较小的堆，并且将针放在较小的干草堆中，那么针需要制作较少的副本，以便在较小的堆中足够可见，因此将需要更短的时间来检测。我们使用了相同的策略。当我们将化验病毒和SARS-CoV-2病毒划分为2万个小孔时，其小孔中的每种病毒可以比其他孔中的病毒更快地被检测到。”

为了测试deCOViD在临床测试中的可行性，研究人员测试了从鼻拭子中获得的四个样本，其中包括两个SARS-CoV-2阳性样本，一个SARS-CoV-2阴性样本和一个流感样本，并将其与他们将传统的基于CRISPR的多步骤分析称为“批量分析”。为了确认结果，所有测试均针对标准PCR分析。

这组作者写道：“批量测定和deCOViD两种方法都从两个阳性样品中产生的信号要比阴性样品中的信号高，这表明成功的检测结果与RT-qPCR一致。” “此外，对于流感样品，本体测定法和deCOViD产生的信号与阴性样品的信号没有区别，与RT-qPCR相匹配，同时也说明了这两种方法的特异性。”

在最终测试中，研究小组将其鼻样本稀释了两倍，发现该病毒在批量检测中变得不可检测，但被deCOViD成功检测到。这是因为RNA扩增和采样是在数字反应孔中进行的，其中靶标的每个拷贝都以局部升高的浓度进行分离，从而促进了与初始样品浓度无关的快速扩增。这不仅提供了更灵敏的测试，而且增加了检测时间。

什么时候将它们用于前线?

Wang补充说：“到目前为止，我们的工作一直是学术上的追求，但我们当然有兴趣将其检测方法商业化，并为在不久的将来对SARS-CoV-2进行大规模筛选和检测做出贡献。” “预计用户友好性方面的几项改进可以促进我们工作的商业化，其中包括简化数字芯片的荧光检测和样品加载过程的自动化。”

他继续说，还可以进一步优化检测成分，以更快，更直接地从唾液等不同样品中检测SARS-CoV-2。也可以通过使用与数字芯片兼容的商用芯片读取器或通过实施基于移动电话的荧光检测系统来简化荧光检测。

该团队在论文中写道：“由于deCOViD可以很容易地设计用于其他DNA或RNA靶标，因此我们预计将其应用于其他疾病。” “基于令人鼓舞的结果和改进的潜力，我们相信deCOViD可以为推进CRISPR / Cas辅助诊断测定法开辟一条新途径，并为对抗COVID-19流行病及其他流行病提供新的工具。”

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