给Cas9一个on开关 更好地控制CRISPR基因编辑

CRISPR-Cas9是一个革命性的工具，部分原因是它的多功能性：细菌产生的咀嚼病毒，它在人体细胞中进行各种遗传技术方面同样有效，包括剪切和粘贴DNA，进行精确突变以及激活或失活一个基因。

加州大学伯克利分校的研究人员现在通过提供一个“on”开关使其更加通用，允许用户在除了指定目标之外的所有细胞中保持Cas9基因编辑器关闭。

重新设计的Cas9酶——被研究人员称为ProcaS9含有一定长度的蛋白质，需要在酶结合和切割DNA之前被切割。如果科学家插入一小块蛋白质，它只能被特定的酶切割，例如专用于癌细胞或传染性病毒或细菌的酶，那么这种酶将成为打开Cas9的触发器。

ProCas9基本上“感知”其所在的细胞类型，基于蛋白质裂解酶(一种所谓的蛋白酶)的存在。

加州大学伯克利分校分子细胞生物学副教授大卫萨维奇(David Savage)说，“这是一个额外的安全层，可以放在分子上，以确保精确切割。”

除了可编程输出，它还提供Cas9蛋白可编程输入。

“有许多蛋白酶调节细胞内的信号通路，将正常细胞变成癌细胞，并参与病原体感染，”萨维奇说。“如果我们能感觉到这些信号，我们就能利用这些重要的方式并做出相应的反应。”

在这项研究中，Savage和他的同事通过使Cas9对植物和人类病毒(如西尼罗病毒)敏感，证明了Cas9的蛋白酶控制。未来，他们相信这项技术可以用来将CRISPR-Cas9细菌免疫系统引入植物，帮助它们抵抗有害的病毒病原体。

来自加州大学伯克利分校和旧金山格莱斯顿研究所的研究人员的研究将于1月10日在《细胞》杂志上在线发表。

拆除外壳的必要性9

萨维奇最初的研究目标是砍掉Cas9蛋白质中最简单的部分——实际上是剪掉DNA进行基因编辑的“剪刀”——以获得最强大的基因编辑器。越简单，越容易使用和运输到细胞中。

“我们知道Cas蛋白很复杂，它们具有各种调节作用，这对它们在细菌免疫系统中的功能至关重要，”他说。“我们工作的主要目标是驯服它们供人类使用，并摆脱与基因组编辑无关的不必要的东西。”

特别是，他想重新设计Cas9，使其更容易附着其他蛋白质。这将允许Cas9携带具有多种功能的蛋白质到DNA上的正确位置。这些被称为融合蛋白，它们有希望的变体可以改变基因表达，或者在一种被称为碱基编辑的技术的情况下，以精确的准确性改变DNA中的一个碱基或核苷酸。

他用来重新设计Cas9的技术称为循环排列，从未尝试过像Cas9这样复杂的蛋白质。环形排列包括取出Cas9蛋白质的氨基酸链并切割它，交换两个片段的顺序，然后允许它折叠成新的3D构型。他这样做是为了将蛋白质分成两部分。

虽然你可能会认为这样会彻底破坏蛋白质，但在10%左右的情况下，新的蛋白质仍然起作用，就像他只是把蛋白质的亚基以不同的方式重新排列，而不影响它们的功能。这可能是有效的，因为正如CRISPR-Cas9的发明者Jennifer Doudna和她的同事所展示的那样，Cas9蛋白质复合物具有高度的柔性，当它捕捉到引导RNA时，它会移动，与dna结合，并移动到DNA链被切割的位置。

Savage目前正在探索一些Cas9重排，这可能为融合蛋白提供更好的支架，并使它们更接近其目标DNA链。

在重新排列Cas9支架的过程中，他意外发现自己重新连接两个蛋白质片段的方式不同。

“当我们切割蛋白质并将旧片段移动到蛋白质中的新位置时，系统对两个片段连接在一起的方式变得非常敏感，”他说。“我们意识到，我们可以利用这种敏感性来设计蛋白质，以获得蛋白酶识别位点。”

这项研究表明，“我们并不坚持蛋白质，大自然赋予的基因组编辑器，”他说。“这些蛋白质可以仔细优化，成为自然界中没有的支架，但它们具有适合人类细胞的特性。”

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